摘要
藻胆蛋白、类胡萝卜素和岩藻黄素是从微藻和蓝藻中提取的光合色素，作为健康食品着色剂和化妆品具有巨大的生物技术应用潜力。藻蓝蛋白具有明亮的蓝色，具有荧光特性，可用于免疫学论文的试剂。藻蓝蛋白最重要的来源是平节螺旋藻蓝藻，然而，最近，硫红藻也被确定为这种蓝藻。藻蓝蛋白商业化的主要障碍是其化学不稳定性，大大降低了其保质期。此外，制药应用所需的高纯度需要几个步骤，这增加了生产时间和成本。微藻(小球藻、Dunaliella、Nannochloropsis、Scenedesmus)产生几种光收获类胡萝卜素，由于其清除自由基的特性，它们能够应对氧化应激，这使得它们适合用作天然抗氧化剂的来源。许多研究集中在最有希望产生有价值的类胡萝卜素的菌株的选择及其提取和纯化上。在海洋微藻产生的类胡萝卜素中，岩藻黄素含量最多，占类胡萝卜素总量的10%以上。尽管生产岩藻黄素的微藻丰富多样，但只有少数几种已被研究用于商业生产，最相关的是三角褐指藻。由于其抗氧化活性，岩藻黄质可以为预防和治疗与生活方式有关的疾病带来各种潜在的益处。本文综述了这些重要色素的生产、提取、纯化和商业化等方面的主要研究成果，为微藻的培养作为天然色素的来源提供参考。
图形抽象
1 藻胆蛋白
藻胆蛋白(PBPs)是一种颜色鲜艳的蛋白质色素，它是由一些藻类产生的光合作用的光收集天线复合体，如红水藻、隐单胞菌、绿藻，尤其是蓝藻。这些化合物在蓝藻中的生物学重要性可以通过它们产生的大量PBPs来证明，在一些生物体中，PBPs可以代表高达50-60%的可溶性蛋白[1]，如Arthrospira platensis或A. maxima。事实上，PBPs是蓝藻的主要辅助色素。在这些生物中，PBPs也是氮储存化合物，当氮饥饿发生时，PBPs会被分解[2,3]。PBPs通常根据其在光谱可见区域的吸收最大值(Amax)进行分类。最常见的PBPs是藻蓝蛋白(PC, Amax = 610-625 nm，蓝色)、异藻蓝蛋白(APC, Amax = 650-660 nm，蓝绿色)和藻红蛋白(PE, Amax = 490-570 nm，红色)。其结构如图1所示[4,5,6,7,8]。这些色素的主要成分是蛋白质亚基α和β，它们构成“单体”单位(αβ)。各种单位自组装成PBPs，这些PBPs在体内被组织在类囊体膜上，形成更大的蛋白质复合物，即藻胆异构体[9](图2a[10,11])。构成藻胆体的PBPs的数量和类型在一个物种的个体(由于生物体的环境适应)和物种之间都是可变的[12]。藻胆酶体的一般结构如图2b所示。蛋白质的鲜艳颜色是由于配基:共价结合的四吡啶衍生物(如藻蓝胆素(图3a)或藻红蛋白(图3b))，受蛋白质主链保护，并以适合于有效地将光能(从PE到PC，最后到APC)输送到叶绿素光系统中心的几何形状(扩展构象)进行阻挡[9]。在藻胆体中，具有最高能态的色素PE总是占据复合物的最外层位置。向内是PC，最后在光合叶绿素中心旁边是能量状态最低的色素APC，如图2b所示。
[4,5]异藻蓝蛋白(APC, Synechococcus elongatus PCC 7942)、[5,6]藻蓝蛋白(PC, Synechococcus elongatus PCC 7942)和[7,8]藻红蛋白(PE, Palmaria palmata)的晶体结构
藻胆酶体:(a)低温电镜图像(Porphyridium purpureum)[10,11]和(b)一般结构图。APC藻蓝蛋白，PC藻蓝蛋白，PE藻蓝蛋白
(a)藻蓝胆素和(b)藻红蛋白的结构
当提取而不参与能量转移过程时，这些分子表现出荧光，其特征是量子产量非常高。由于其显著的特性，PBPs在食品、化妆品、制药和生物医学领域具有多种生物技术应用。在pbp中，PC拥有迄今为止最大的市场。这些水溶性色素的安全性和健康性促进了其越来越多的利用，正如近年来发表的大量论文所证明的那样[1,3,13,14,15,16,17,18,19,20,21]。
PBPs在流式细胞术和免疫分析中用作天然化妆品染料或荧光探针(特别是APC和PE)。A. platensis(螺旋藻)蓝色水提取物，含有PC和APC，已被欧洲食品安全局批准(法规(EU) No 1333/2008和No 231/2012)作为食品色素。美国FDA将PC (21CFR73.1530)归类为天然食品色素添加剂。PC和PBPs具有抗氧化、抗炎、神经保护、抗癌和免疫调节等治疗作用[1,3,13,14,18,19,21,23,24,25,26,27]。
PBP的商业价值在很大程度上取决于其纯度等级，纯度等级通常由PBP在光谱可见区域的最大吸收值与280 nm处的吸光度值之间的比值来评估，该吸光度值与产品中可检测到的蛋白质总量有关。PBP纯度大于0.7为食品级，大于1.5为化妆品级，大于3.9为反应级，大于4.0为分析级。荧光剂通常要求纯度大于3.0，而生物医学和治疗应用则要求分析级PC[28,29]。尽管对安全天然产品的需求不断增加，但PBPs的广泛使用仍然受到大规模生物质生产成本[30,31,32]以及提取和净化方法的限制。
1.1 提取纯化方法
提取和纯化仍然过于昂贵，相当复杂且耗时，而工业需要简单，廉价且易于扩展的程序来实现PBPs的可持续生产[3,14,22,29,33,34,35]。此外，二氧化碳和其他温室气体排放增加导致的气候变化，以及严重污染导致的世界范围内日益恶化的环境，都要求工业迫切需要遵守现行的指导方针和法规，逐步减少二氧化碳排放和能源消耗，推动基于采用可持续进程的“绿色革命”。因此，由于世界对安全、无毒、健康的生物产品的需求不断增加，因此对可持续、环境友好、绿色化学提取/纯化工艺具有很高的工业和商业兴趣，以便在使用最少步骤的情况下大规模提供各种纯度等级的PBPs(特别是PC)。
Tan等[17]最近使用文献计量学方法回顾了PBPs的研究趋势。他们发现，文献中主要解决的问题是微藻培养参数的优化和PBPs提取方法的优化。此外，PBPs的生物活性特性和提取是未来研究的重点。
事实上，一个快速的参考书目调查可以很容易地显示出人们对这些化合物的提取和纯化越来越感兴趣，这一点在过去几年越来越多的发表的文献中得到了证明。例如，一项于2022年8月1日基于Scopus数据库(结合藻胆蛋白、藻蓝蛋白、藻红蛋白、异藻蓝蛋白、提取纯化和排除假文献)进行的调查表明，2021年发表的文献数量[83]比十年前增加了四倍多[19]。图4报告了2000年至2021年调查中每年检索的文档数量，图5报告了同一时期使用同一数据库检索的文档数量，涉及所采用的提取(图5a)和纯化(图5b)方法。大多数情况下，各种提取，特别是各种纯化方法结合起来，按顺序使用，以获得更好的结果。
从Scopus数据库检索2000年至2021年发表的文献，结合藻胆蛋白、藻蓝蛋白、藻红蛋白、异藻蓝蛋白等术语，提取和纯化，并消除虚假文献
根据采用的(a)提取和(b)纯化方法(Scopus数据库)于2000年至2021年发表的文献。
文献调查表明，超声辅助提取是最常用的PBPs提取方法(图5a)。超声辅助提取被认为是一种绿色工艺[36]。它需要短的操作时间和低溶剂消耗，从而实现高收率，但PBPs样品是温度敏感的化合物，必须控制和避免温度的升高，以保持PBPs的功能[3,34]。原则上，超声辅助提取适用于大规模提取PBPs，但一般纯度较低[37,38,39]。其他用于提取PBPs的绿色方法有高压法、脉冲电场辅助法和微波辅助法。尽管有报道称高压工艺(如施加压力在300-600 MPa左右的静水压力处理，以及施加压力通常在400 MPa以下的高压均质处理[40])可能表现出较低的选择性[34]，但据报道PC提取的结果良好[41]。除了被认为是环保的，这种方法也适用于PBPs的大规模生产。另外两种被认为是绿色的方法是脉冲电场辅助和微波辅助提取。然而，两种方法引起的样品温度升高，以及脉冲电场辅助提取中可能出现的电极腐蚀和金属泄漏，都限制了这两种方法在PBPs提取中的应用[34,36]。酶辅助提取和重复冻融是另外两种流行的方法(图5a)。酶辅助提取可以保证高产量，但由于市售酶的高成本，它并不特别适合大规模生产PBPs[36]。相反，重复冻融虽然耗时，但因其简单、可重复性好、成本适中等优点，特别具有吸引力。因此，通常用于处理少量生物质。事实上，与其他方法相比，反复冻融可以有效地裂解细胞，并确保更高的纯度[3,34]。然而，它不能被认为是一个通用的方法，因为一些蓝藻或藻类物种的细胞太硬，不能被冻融打破，需要一个不同的方法。事实上，不存在单一的优选PBPs提取方法，而是必须为每个物种选择和优化。此外，在选择最佳提取方法时，必须考虑作为色素来源的生物质类型(新鲜、喷雾干燥、冷冻干燥、烘箱干燥等)。
在提纯方法方面，图5b显示了硫酸铵沉淀(或盐析)是最常用的方法。事实上，硫酸铵盐析广泛用于蛋白质纯化过程[42]，包括PBPs[43]，并且最常用于纯化前步骤，以获得高纯度的PBPs[44](见表1)。最高纯度的PBPs通常通过柱层析，特别是离子交换层析，或利用液体(特别是水)两相体系[1,35]来实现。然而，柱色谱法很难扩大规模，而水两相体系更适合大规模生产PBPs[18]。最近，膜色谱法已被用于获得分析级PBPs[29,45,46]。这种方法很有趣，因为从根本上来说是“绿色”的，具有成本效益，对环境友好，适合在工业规模上使用[47]。表1显示了文献中可用的PBP提取和纯化程序的摘要。
1.2 主要enviro影响藻蓝蛋白产量的环境因素
如前所述，目前，在PBPs中，PC占据了最大的市场领域，因为它广泛应用于食品行业。如今，PC的商业化生产几乎完全依赖于节螺旋藻(螺旋藻)生物量。2013年和2014年，美国批准将节螺旋藻提取物用于糖果、口香糖和其他类型的糖果中[104]，而欧盟于2013年批准节螺旋藻提取物作为食用色素[105]。这一决定是基于这样一个事实，即几个世纪以来人们一直食用Arthrospira，并且在世界范围内食用Arthrospira被认为是安全的[106]。因此，有关PC的生产、提取和纯化的信息主要来自节螺旋体的培养。
1.2.1 "光强和光谱
光强和波长都能强烈地改变生物量中PC的生产力和浓度。一般来说，通过将细胞暴露在低强度入射光下或通过增加培养物密度来适应弱光，会提高叶绿素和PC含量[31]。在platensis培养物中，在对数生长阶段，叶绿素a (Chl a)的百分比从干重的0.8%增加到1.6%，而PC的百分比从初始值的3%增加到12-14%，这取决于培养物生长的菌株和光谱[32]。
考虑到PC的高市场价值，生产中经常使用人造光。微藻培养采用荧光灯和发光二极管(led)，具有不同的光谱和能量转换效率。荧光管具有以360度角提供光辐照度的优点，并且与led相比，荧光管通常具有更大的发射带。然而，由于体积小、重量轻、耐用、能量转换效率高和使用寿命长，led已经引起了藻类生物质生产商的兴趣。led的一些优点促进了其作为微藻生长的光源的扩散，最近对platensis的生长进行了使用荧光灯的研究[32,107]。
藻青菌a . platensis下照明与灯光的不同的颜色(白色,橙色和蓝色)显示吸收峰的蓝色和红色光谱的一部分(440和680海里),由于的背影,和橙色部分(620海里)由于PC(图6)。PC之间的比例在620年达到顶峰的背影在680纳米和纳米细胞生长在蓝光高于在橙色和白色的光,蓝色灯光下指示PC含量的增加。
白、橙、蓝三种光下生长的platensis细胞体内光吸收光谱，改编自[32]
有人提出，蓝光会造成两种光系统之间的不平衡，导致platensis光合电子传递链的PSI侧能量过剩，而PSII侧能量不足[32,108]。众所周知，蓝藻在PSI中投入的叶绿素a比在PSII中投入的叶绿素a要多得多[109,110]。这两种光系统之间的不平衡由主要与PSII相关的捕光藻胆体(PBSs)来补偿[111]。通过这种方式，蓝藻在两个光系统之间保持平衡的激发分布，使其能够产生生长所需的ATP和NADPH。在蓝光下，PBSs不能有效地吸收蓝色光子，因为它们的短波长450 nm与PC的吸收光谱(峰值在620 nm)不一致。因此，在蓝光下，PBSs几乎不向PSII转移任何能量。另一方面，在PSI中更丰富的Chl a可以有效地将能量传递给PSI。此外，在蓝藻中，β-胡萝卜素在PSI中比在PSII中更丰富，可以有效地吸收蓝光，从而进一步促进PSI的光合作用光收集。因此，在蓝光下，与PSI相比，PSII的光子严重短缺，在线性电子输运方面有很强的局限性。因此，细胞通过增强通常服务于PSII的PBSs的产生来适应蓝光，从而恢复两个光系统之间的平衡。然而，这种策略对增长是无效的，因为PBSs不吸收蓝光。这些事实有力地支持了在蓝光下生长的培养物与橙光和白光相比生长速度要低得多，但PC含量明显更高的研究结果。[32]
目前的共识是蓝光会增加节螺旋体细胞中的PC浓度，而在促进生长方面效果较差，在白色或橙色光下培养时，PC浓度要高得多[32,112]。因此，可以采用两步法生产富含PC的节螺旋体生物量，首先在橙色或白色光下培养，一旦培养达到固定阶段，将光调到蓝色以进一步提高PC含量。由于PC的合成需要大量的氮，而蓝光照射可以刺激蛋白质的合成[113,114]，因此在积累阶段避免氮剥夺是很重要的，这可能发生在生长末期。这一步缺氮甚至会导致PC浓度降低，因为PC会被细胞用作氮源[2]。因此，建议采用两步法来提高工艺的经济可行性[115]。
1.2.2 氮源对藻蓝蛋白产量的影响
PC是细胞内的氮源，可以在长时间的限氮条件下使用[2,32]。因此，PC的含量受培养基中氮源的性质及其浓度的强烈影响。培养基中硝酸盐的消耗会导致PC的减少，而硝酸盐的过量则会导致PC的抑制[116]。根据[116]，高浓度PC的最佳硝酸盐浓度在1200 ~ 1600 mg/l之间。在Zarrouk培养基中添加谷氨酸和琥珀酸，使PC浓度提高了约20%[116]。PC含量增加的原因是，在蓝藻细胞中，谷氨酸和琥珀酰辅酶A是包括藻胆素在内的四吡啶生物合成的中间代谢物[116]。氮源类型对生物量中PC的产生和浓度有重要影响。利用不同氮源(NaNO3、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl和尿素)对platensis进行的研究表明，使用(NH4)2SO4可获得最高的PC产量。较高的生物量生产力也伴随着较高的PC含量(11.3%)[117]。
铵是一种比硝酸盐更容易还原的氮形式，这可能解释了更好的培养性能，特别是在蛋白质含量很高(60-70%)的蓝藻节肢藻中。然而，在典型的节螺旋体培养物pH高于9时，氨(NH3)是主要的化学物质，其通过细胞膜的扩散导致氨在细胞内积聚，从而产生毒性作用[118]。氨对PSII络合物的出氧络合物的锰(Mn)簇造成损伤，导致PSII对光损伤的敏感性显著增加[119]。叶绿素荧光测量结果表明，PSII损伤与光强有关，并且氨对PSII性能的抑制既不能通过在黑暗中重新培养细胞，也不能通过降低氨浓度来缓解[120]。高生物量密度和无pH调节的A. platensis培养物对氨抑制的敏感性较低，这很可能是由于培养基中氨的同化速度更快[121]。尽管如此，在节螺旋体培养中使用铵盐作为氮源时需要小心，特别是当pH值不受控制时，因为它可能发生在大型池塘中。此外，在高pH值下，一定量的氨通过放气损失，导致大气中释放的温室气体增加，成本增加。由于这些原因，铵应以进料批的方式供应，以防止积累。最常用的氮源仍然是NaNO3，因为它可以大量提供给培养物(在Zarrouk培养基中为2.5 g/l)而不会引起毒性问题。类似的问题可以预见的使用消化生物质生产的蓝藻。这种废物是氮和磷以及其他少量营养物质的极好来源。消化液中氨态氮的含量在500到2000毫克/升之间，因此不可避免地要用淡水进行稀释。目前，欧盟国家对消化物的使用似乎仅限于生产用作饲料的生物质。然而，立法并没有明确允许或禁止使用泥浆来种植藻类，因为它被允许用于饲料链中的陆地植物[122]。
1.2.3 高溶解氧对co的影响浓度和光暗循环
配备桨轮的大型滚道池通常具有低湍流的特点，在节螺旋体培养中，通过增加桨轮的旋转或通过其他方式实现更快的混合可能导致细丝断裂和泡沫形成，并不断增加生产成本。因此，除氧通常是有限的，O2浓度达到空气饱和度300-400%的情况非常频繁，特别是在下午[123]。传质系数在反应器的各个部分变化很大:Kla在靠近桨轮处较高(约164 h−1)，而在通道和弯道处则急剧下降(低于1 h−1)。这清楚地表明，培养物混合不良，不能充分剥离氧气[124]。可以通过在注入空气的地方放置一个贮水池来改善氧剥离。然而，需要注意丝状蓝藻，如节旋藻，因为在压力下注入空气可能导致毛状体的破碎和漂浮。
氧对大众文化生产力的负面影响多年来一直被忽视。Torzillo等人[125]报道的证据表明，在节螺旋体培养中，超过30 mg L−1的氧浓度对生长和生物量蛋白质含量都有负面影响。然而，在封闭系统中培养微藻时，氧毒性问题变得明显[126]。只有少数研究解决了单线态氧作为对超光环境恢复力的标记的潜在作用，并找出单线态氧恢复力是否与菌株在超光环境中的稳健性相关。
Hiday和Belay[127]研究了大型池塘(0.5 ha)中节肢螺培养物光合色素的日变化过程。PC含量的较大变化与池塘中较高的溶解氧浓度相关。PC含量的波动趋势与氧浓度的波动趋势相反。很明显，PC的最低水平与氧的峰值一致[127]。
PC的浓度在白天也会随着光照条件的变化而变化，随着光照的增加而降低。在低密度文化中，尤其是在夏季，PC的变化尤为明显。PC含量通常在上午较高，特别是在低密度培养中。通常，在暴露于强光下的节螺旋体培养物中，白天会积累碳水化合物。由于夜间碳水化合物的呼吸作用，PC的浓度会在早晨显著升高[127,128]。因此，采收生物量的时间会影响生物量中PC的含量。
1.2.4 温度的影响
由于季节和昼夜波动，光和温度是微藻生物量生产的主要生物学限制因素。然而，正如Borowitzka[129]所指出的，温度对生产力起着最重要的作用，因此它可能应该是菌株选择的第一参数。以A. platensis为例，实验室实验表明，节肢螺在35℃的最佳温度下生长时，生物量产量最大[130,131,132,133]。然而，在室外，在露天池塘中，培养温度可以从清晨的15°C波动到中午的35°C左右，导致生产力显著降低和生物量组成的变化[127]。采用适应不同季节不同温度的不同品种，有利于延长栽培期，提高全年产量。该策略已在美国加利福尼亚州的Earthrise农场用Arthrospira进行了成功的试验[134]。
对聚珠球菌(Synechococcus sp. PCC 7002)的研究发现，该菌株的最佳生长温度为38℃，当该菌株在15℃下生长时，细胞会以类似于营养饥饿的方式失去蓝色[135]。糖原积累较强，PBP和叶绿素含量下降。相比之下，当细胞以尿素作为氮源生长时，细胞生长正常，没有任何褪绿迹象。作者推测氮同化的缺陷很可能是由于硝酸盐在细胞质膜上的运输效率低下。
综上所述，蓝藻(尤其是节旋藻)的PC生产强烈依赖于保持细胞暴露的最佳温度和光照条件，这两个环境因素可以在全年和白天发生强烈变化。培养体系可以影响温度分布和光吸收。温度的控制在封闭系统中更容易实现，而在开放池塘中更难实现。在这个系统中，我们经常观察到，与光相比，早晨的温度上升得不够快，而光和温度上升之间的不同步可能导致细胞光抑制[136,137]。
1.3 应变selec优化选择
令人惊讶的是，虽然用于工业目的的节螺旋体的培养可以追溯到几十年前，但在选择更新更多产的菌株方面取得的进展却微乎其微。事实上，应变性能的任何提高都会立即反映在工业应用中。阻碍系统的菌株选择活动的因素是必须有大量的菌株集合，这需要大量的人力来维持它，以及环境因素决定的PC含量变化太大，这使得菌株之间差异的评估更加复杂。此外，值得指出的是，由于节肢旋虫菌株具有较高的形态可塑性，一旦转入批量培养，所选实验室菌株的表现可能与原始实验室菌株有显著差异。事实上，在室外，菌株受到环境因素的强烈变化，特别是光、温度和氧气暴露，以及混合引起的水动力应力，这可以强烈地改变毛状体的形态及其生化组成。同一菌株的长时间培养可以产生性能改善的表型，对温度和光照胁迫具有更高的适应性。这可能证明种植者不愿意改变他们的菌株，以及保证产品的恒定生产和一致的生化特性的必要性。此外，与传统菌株相比，采用较高PC含量的菌株用于工业生产必须证明具有经济优势。换句话说，PC含量的增加不应以减少生物质产量为代价。因此，菌株的生物量生产力是菌株选择过程中不可忽视的一个重要方面。此外，经常发生的情况是，色素的生产者通常不是种植者，生产者感兴趣的是更便宜的生物质，而不是生物质中高浓度的色素(Vonshak，个人通信)。
对一个耐NaCl突变体的菌株选择表明，在pH为9.0的硝酸盐和碳酸氢盐充足培养基(分别为40和60 mM)中培养，在光养条件下，与野生型相比，PC产量提高了12.2%[138]。在调查的13种蓝藻中，Arthrospira sp.、Pseudanabaena sp.和Synechococcus elongatus可能分别是PC、PE和APC的有希望的商业生产来源[139]。值得注意的是，聚囊藻的特定生长率和生物量生产力显著高于其他蓝藻。这归因于较高的表面体积比(S/V)，使这种蓝藻能够吸收更多的营养[140]。
对不同地理区域(阿尔及利亚、乍得、美国)的platensis菌株的生化组成进行了比较。与其他菌株相比，来自美国的节螺旋体菌株的PC含量(占干重的百分比)最高[141]。
表2显示了不同节螺旋体菌株中PC的含量。为了便于不同菌株之间的比较，对培养条件进行了规定。还指出了菌株和存管机构的地理起源。
1.4 生产C-PC用Galdieria sulphuraria:节螺旋体的替代品
硫酸Galdieria suluraria是一种红色的(红水藻)多极端微藻，它可以耐受非常低的pH值(低至0.2)，温度高达57°C[77,143,144]，高渗透压，高达400 g L - 1的糖和2-3 M的盐。与节肢螺类似，它只含有叶绿素a，辅助光合色素由蓝色的PBPs、PC和APC代表。这种生物可以异养生长(在黑暗中)，其中有机基质代表碳和电子的来源，也可以自养生长(在光照下)，其中通过PSII分解水产生还原力，而碳的来源是CO2。它也可以混合营养生长，即异养和自养相结合[145,146,147,148]。它们相当独特的应对非常恶劣生长条件的能力，甚至在异养中也大大降低了污染的风险，使这种生物非常有吸引力产生PC和蛋白质(高达72%)，与节螺旋藻和小球藻相比，它们也含有更丰富的必需氨基酸[146]。由于该生物与节螺旋体不同，没有作为食品和饲料使用的历史记录，因此被欧盟法规认为是潜在的新型食品，因此需要在批准前完成作为新型食品的准入程序[148]。Galdieria的自养培养需要仔细选择细胞密度和光照供应，以避免光抑制的风险[146]。这种现象可能发生在密集培养的强烈稀释后，其中大多数细胞已适应弱光，因此可能遭受特定光供应的突然增加。虽然这个问题可以很容易地在实验室中通过暂时减少光供应来解决，但当在太阳能下使用大规模生物反应器时，它可能会成为一个问题。光抑制的风险与混合营养培养的相关性较小，特别是当它们根据“氧平衡”制度生长时，在这种制度下，底物的供应和氧气的摄取与光合作用平衡[145]。这种培养模式允许保持反应器关闭，从而降低了可能通过在反应器中注入空气而发生的污染风险。
在异养条件下，葡萄糖和甘油培养物的PC含量非常低，分别为0.3 ~ 0.6% DW。在自养培养下，PC含量分别高出40倍和20倍[147]。这些结果表明，异养抑制色素合成，特别是在葡萄糖生长的细胞中。[148]。在葡萄糖上生长的异养细胞变成黄色，而在甘油上生长的细胞仍然保持绿色。当葡萄糖被完全消耗时，细胞中的色素沉着得以恢复。据[149]报道，G. suluraria菌株074G在异养条件下，在限碳培养和足氮培养中，PC含量在干重的0.8 - 1.2%之间，而在缺氮细胞中，PC含量下降到0.1%。因此，尽管异养培养获得了更高的体积生产力，但这种生物质中的PC含量太低，无法进行经济提取，限制了商业应用。事实上，根据欧盟的规定，原料中色素的浓度决定了提取物可以被认为是具有着色特性的食品提取物(> 3%的干重)，还是仅仅是天然的食品添加剂(< 3%的干重)[150]。此外，虽然食品提取物被认为是食品成分，并用于清洁标签食品，但天然添加剂需要“E”号。因此，由于PC的含量，异养Galdieria生物量的PC提取物属于添加剂类别，而自养和混合养培养的PC提取物则属于第一类，不需要任何标记。
提出了一种将G. suluraria的高生物量积累与高PC水平相结合的策略[151]。它包括在异养状态下连续生产生物量，然后稀释和暴露于光下以诱导PC的合成。这种方法可使PC含量提高13.88%，高于自养或混合养培养的水平。虽然这种策略可能很有吸引力，但自养、混合养和顺序异养/自养之间的经济比较需要评估。顺序异养/自养策略需要在光照前强烈稀释培养物，这增加了收获成本，特别是单细胞微藻(表3)。
另一种嗜热嗜酸的红色微藻，Cyanidioschyzon merolae，属于红藻门Cyanidiophyceae目，已被提出用于PC的生产[152]。与G. suluraria类似，它在pH值在0.5到3之间的环境中茁壮成长，并耐受高达56°C的温度。事实上，将覆盖70%以上G. suluraria基因组的表达序列标签和高通量基因组序列reads与Cyanidioschyzon merolae基因组进行了比较，发现超过30%的Galdieria序列与Cyanidioschyzon的任何基因都不相关[153]。与Galdieria具有较大的代谢灵活性相反，C. merolae是专性光自养生物，这将其培养限制在自养条件下(光和CO2)。有趣的是，它没有细胞壁，这使得仅使用渗透冲击和离心就可以以高纯度(高达9.9)提取PC。在pH 4 ~ 5 ~ 80℃范围内，菌体PC稳定。由于使用该物种生产的PC纯度很高，无需使用耗时和昂贵的纯化程序，因此可以评估其用于生产分析/试剂级PC的使用情况。然而，该物种的有效性能需要在大众培养中进行评估，其中水动力应力可能严重阻碍其培养。
1.5 试图提高藻蓝蛋白的稳定性
事实证明，PC分子对温度、pH值和光线等环境因素非常敏感，这些因素会导致蓝色褪色，甚至完全失去颜色。这一事实严重阻碍了其在食品和化妆品中的应用。因此，人们一直在努力寻找防止PC退化的最佳条件，从而延长其保质期。通过使用防腐剂和配方工艺，提出了不同的稳定技术。食品级PC通常用于评估其降解程度，通常采用紫外-可见分光光度法在620 nm处测定。PC分子的稳定性也受其纯度的影响。通过对反应级PC和食品级PC的比较，发现食品级PC具有更高的热稳定性[154]。然而，值得注意的是，硬纯化过程会影响色素的稳定性。一般来说，温和的提取和纯化程序有望更好地保持PC的稳定性。大多数关于PC稳定性的研究都是从Arthrospira (spirina platensis)中提取的PC进行的，Arthrospira (spirina) platensis是目前世界上使用的PC的主要来源。
1.5.1 影响温度和使用防腐剂，以提高热稳定性
温度影响PC的稳定性[[155]及相关文献]。从13个分离的蓝藻中提取的总PBPs在−20°C孵育24小时后的稳定性是可变的。PBP含量损失范围为4.88% ~ 15.94%。在24 h内，Pseudanabaena sp.总PBP含量的稳定性最高(下降4.88%)，而Desertifilum sp.提取物的PBP含量下降最多，下降15.94%[156]。这些发现可能表明，PBPs的稳定性可能与蓝藻种类和/或菌株有关。最近，来自嗜热蓝藻热共生球菌(Thermosynechococcus elongatus)的藻蓝蛋白的异源表达被应用于嗜热蓝藻共生球菌(Synechocystis sp. 6803)中，以生产耐热PC[103]。重要的是，聚囊菌突变菌株的PC产量与野生型聚囊菌的本地PC相当，而PC的热稳定性与T. elongatus相当[103]。
通常，对温度影响的实验都与使用防腐剂来提高颜料的稳定性有关。节肢螺生物量的PC在47 - 64°C的温度和5.5-6.0的pH范围内孵育，使其浓度降低了50%[157]。加入20-40%葡萄糖或蔗糖，60℃加热15 min, pH 7.0时PC的CR(相对浓度)值保持在62-70%左右，半衰期从19 min增加到30-44 min。添加2.5%氯化钠对pH 7.0时PC的保鲜效果更好，保留了76%的PC浓度[157]。
PC在温度高达45℃时稳定，但在45 ~ 70℃时稳定性成比例下降。氯化钠(20% w/w)是一种有效的PC稳定剂，且浓度越高，其效果越好[158]。
与其他研究一致，在74°C的温度下，PC的降解增加(12.5 9.7 min, pH 6.0)[159]。然而，PC的稳定性在研究的物种中可能会有很大差异。蓝藻A. platensis和多极端微生物G. suluraria (Rhodophyta)的提取物在25至55℃的温度下培养，发现两者的热稳定性不同。在该红藻中，PC吸光度在55°C前保持稳定(初始值的95%)，在55°C和75°C内稳定下降，降至初始值的39%。以A. platensis为例，PC提取物在45°C时已经开始降解，在620 nm处吸光度下降18%，而在75°C时吸光度下降到初始值的20%[146]。[77]和[160]也报道了类似的发现，他们发现G. suluraria的PC在所有条件下都比A. platensis的PC更稳定，特别是在50-65°C范围内和pH 7的中性环境中。在60℃、pH 7条件下培养30 min后，黄颡鱼和白颡鱼的PC保色率分别为86.66%和60.83%。
从G. suluraria中提取的PC所显示的较高的热稳定性可能是生物体对极端环境(温度高达57°C)的长期适应过程的结果，在这种环境中它仍然茁壮成长。总之，温度低于45°C通常被认为是保持PC稳定性的最佳温度。
1.5.2 pH的影响
PC提取物的pH值是另一个能使色素不稳定的环境因素。溶液的pH值也可以改变PC溶液的颜色。在中性pH下，PC的颜色被认为是蓝色的，而在酸性pH下，它是绿色的。PC的最佳pH范围为5.0 ~ 6.0[158]。通常，在饮料中添加酸性化合物是为了提供酸味和浓烈的味道，以平衡饮料中添加的糖的甜味。据报道，在pH 5.5到3.5的范围内，节肢螺提取物在620 nm处的吸光度下降了60%，而在相同的pH范围内，Galdieria提取物保持了100%的吸光度。此后，稳定性呈线性下降，在pH 1.5时达到初始值的30%左右。[146]如上所述，G. suluraria PC提取物对高酸度的耐受性显著增强，这可能是该生物长期适应pH低至0.2的极酸性环境的结果。
1.5.3 光的作用
一些研究评估了PC水溶液的降解动力学，使用一级动力学模型评估温度或光作为加速因素，并分别研究了这两种环境因素以评估其影响[158,161]。p
1.5.4 防腐剂的使用
由于PC蛋白结构的降解严重影响其颜色和生物活性，因此添加防腐剂以确保产品的保质期更长[[155]及相关文献]。化学成分和防腐剂浓度都是相关的方面，因为所产生的混合物不得影响人体健康。最常用的防腐剂是单糖或双糖(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖)和多元醇山梨醇[71,154]、有机酸(柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸)以及无机盐中的氯化钠和氯化钙。在酸性防腐剂中，柠檬酸的性能较好。事实上，使用柠檬酸，45天后67%的PC保持稳定，而对照组只有3%[163]。柠檬酸的加入降低了溶液的pH值，柠檬酸的螯合性能也可以解释这一结果。
1.6 市场
PC的商业价值很大程度上取决于其纯度等级。PC作为着色剂在食品和化妆品行业(最大的市场)的商业价格分别约为每克0.35美元和135美元，在治疗和诊断应用中可达到每克4600美元[169]。
图7报告了2020-2027年期间预测的产量(吨)[22]。到2027年，中东和非洲国家的PC总产量预计将增长7.2倍，欧洲国家的产量最高将增长近9倍。在同一时期，预计中东和非洲国家的复合年增长率(CAGR)将在33%左右，而欧盟国家的CAGR将接近41%(图7)。
各国藻蓝蛋白的产量。美联社,亚太地区;NA，北美;EU，欧洲联盟;中东和非洲。Insert显示2000-2027年期间计算的CAGR(%)。数据来源[21]改编
粉末需求的增加是由于其在食品和饮料中用作合成色素的替代品，受到有机和天然成分为基础的食品所吸引的消费者的PC青睐，以及对合成色素的使用提出越来越多限制的法规。西欧是该产品的最大消费国(约占33%)，其中80%的PC生产用于食品工业。制药业是另一个有前景的行业，到2030年可能会有相当大的增长。到2020年，PC营业额将超过1200万美元，预计将以10%的复合年增长率增至3600万美元。除了公认的抗氧化特性外，PC在癌症诊断中的应用在制药行业产生了进一步的需求。到2030年，全球PC市场的营业额预计将超过4亿美元，预计2021-2030年的复合年增长率为9.6%[164]。
图8显示了2020年记录的PC在食品、化妆品和分析/反应物中的份额。可以看出，PC的大部分用于食品，而用于制药的部分则少得多(只有4.4公斤)。然而，当根据市场价值进行比较时，分析反应等级超过化妆品等级，因为它的价格要高得多。
比较不同的PC行业及其各自的市场价值。由于其产量非常低(4.4公斤)，分析级/反应级的市场容量无法得到评估(A/R =分析级/反应级)。数据来源[21]，改编
个人电脑市场的主要参与者包括大地营养有限责任公司、蓝泰克自然有限公司、DDW公司、DIC公司、日本藻类有限公司、Phyco-Biotech Laboratories、Cyanotech corp、Parry Nutraceuticals青岛ZolanBio有限公司、Sigma-Aldrich公司和云南绿A生物工程有限公司、BueBiotech Inc.。Algosource GmbH是一家。
1.6.1 有限公司ncluding讲话
PBPs是一种有价值的、安全的、健康的生物化合物，具有许多生物技术应用和日益增长的全球市场。然而，它们的大规模生产仍然受到现有提取和纯化方法的复杂性和高成本的限制。事实上，PBPs的提取和纯化过程通常涉及许多步骤，这降低了产品收率，增加了成本，影响了大规模开发。由于PBPs对光和温度敏感，大多数建议的程序通常都很耗时，并且可能影响最终产品的质量。
一些已出版的著作谈到了这些关键问题。例如，建议的程序以最少的步骤数为特征，以减少生产时间和成本。一般来说，在这些研究中，避免了以两种不同阶段(提取和纯化)为特征的普通方法。例如，搅拌流化床色谱法[63,165]、水两相体系[166]、甘油基天然深共晶溶剂[167]、三维打印阴离子交换单体[168]和三相分配法[88,97]等方法已经成功地直接应用于蓝藻或藻类生物量，获得了具有商业价值的粗提物，具有良好的纯度等级。最近，一种创新的提取/纯化方法，基于超声细胞裂解在硫酸铵溶液中，从新鲜的A. platensis生物质中获得PC[169]。在这个过程中，PBPs的提取与生物质细胞裂解分离，色素在随后的提取步骤中回收，得到纯度和浓度都提高的粗PC提取物。然而，这种方法的经济可行性应在工业规模上得到证明。新的PC微藻菌株需要从自然界中分离和筛选。以Rhodophyta G. sulphuraria为代表的一个例子，由于其巨大的代谢灵活性和在大多数其他PC生产者禁止的条件下生长的能力，最近引起了研究人员的注意。然而，生产成本与其他PC生产商，如节肢螺需要解决。
目录
摘要 1 藻胆蛋白 2 微藻中的初级类胡萝卜素 3.微藻作为岩藻黄素的来源 数据可用性 缩写 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 相关的内容 搜索 导航 #####2 微藻中的初级类胡萝卜素
2.1 我微藻合成类胡萝卜素的代谢途径
类胡萝卜素的颜色多种多样，从黄色到橙色、红色和紫色。它们由8个异戊二烯单元组成，骨架为40个碳，通常由一个带有9个共轭双键的多烯链和多烯链两端的端基组成。五碳(C5)普遍存在的前体代谢产物二磷酸异戊烯基(IPP)和二磷酸二甲基烯丙基(DMAPP)是产生类胡萝卜素所必需的。两种不同的途径，MEP(甲基赤藓糖醇磷酸)途径和MVA(甲羟戊酸)途径，有助于生物系统中这些化合物的合成[170]。
类胡萝卜素的生物合成途径见图9。焦磷酸异戊烯基(IPP, C5)及其异构体二甲基烯丙基二磷酸(dapp, C5)在叶绿体中通过甲基赤四醇磷酸途径(MEP)以3:1的比例转化为香叶基焦磷酸基(GGPP, C20)。在进一步的反应中，植物烯合成酶将两分子GGPPS浓缩成(15Z)-植物烯(C40)，然后通过植物烯去饱和酶、ζ-胡萝卜素异构酶、ζ-胡萝卜素去饱和酶和胡萝卜素异构酶使其去饱和并异构化为番茄红素[171]。
微藻类胡萝卜素合成途径方案。微藻Dunaliella sp.(红边，直径9 ~ 11 μm)、Nannochloropsis sp.(绿边，直径2 ~ 4 μm)、Scenedesmus(黄边，长11 ~ 18 μm，宽3.5 ~ 7 μm)和Chlorella sp.(橙边，直径2 ~ 10 μm)分别是β-胡萝卜素、紫黄质、叶黄素和番茄红素的主要生产者。虚线表示仍然不清楚的路径
在藻类中产生α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的过程中，胡萝卜素生成的第一步涉及到番茄红素。一个关键的分支点是确定来自α-类胡萝卜素的叶黄素和来自β-类胡萝卜素的β-胡萝卜素的比例。玉米黄质来源于β-胡萝卜素，通过花青素(紫黄素的叶黄素循环)被环氧化成紫黄质。其他由紫黄素衍生的叶黄素有:(i)新黄素，由最近报道的一种类似紫黄素去环氧酶的酶产生[172]，它可以转化为二氧化黄质，而二氧化黄质又可以生成紫黄素和紫黄素;(ii)二氧化黄质，可以去环氧化为二氧化黄质(二氧化黄质循环)。二氧化二黄质和二氧化二黄质都可以转化为岩藻黄质，其酶促途径尚不清楚。
类胡萝卜素根据其化学成分可分为两类:胡萝卜素和叶黄素。黄素，包括β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素、虾青素、岩藻黄素、新黄素和橄榄素，都是带氧原子的类胡萝卜素，而番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素等胡萝卜素缺乏氧。
类胡萝卜素分为初级和次级。主要的类胡萝卜素，如某些叶黄素和ß-胡萝卜素，通常存在于叶绿体中，由于其收集光能的功能，它们直接参与光合作用。
在逆境条件下(营养缺乏、强光、盐胁迫、高低温)，光合系统不能有效利用吸收的光能，耗散过程可能被激活。此外，持续供应的次生类胡萝卜素可以作为自由基和活性氧的猝灭剂。
2.2 主要微藻菌株类胡萝卜素高产
当微藻细胞接收到细胞内高还原状态的信号时，就会启动特定的动作来耗散积累的电子。这些方法需要合成抗氧化类胡萝卜素，如叶黄素、黄素循环色素紫黄质、花青素和玉米黄质，以及主要存在于海藻类微藻褐指藻(Phaeodactylum)和等chrysis中的氯黄质和岩藻黄质[173,174,175]。
黄叶素循环通过类囊体腔酸化激活紫黄质去环氧化酶，通过花青素合成玉米黄质[176,177]。在硅藻和鞭毛藻中，如褐指藻和等chrysis[173]，可以发现一个额外的叶黄素循环，由二氧芑质组成，可以去环氧化成二氧芑质[178]。由于这些循环的诱导，激活了细胞内单线态氧的还原，从而可以避免或减少细胞损伤。一些研究最多、产量最高的微藻菌株的类胡萝卜素产量见表4。
众所周知，在微藻中，雨红球菌、小球藻、盐藻Dunaliella、Scenedesmus、braunibotryococcus、Nannochloropsis、Coelastrella striolata、chlorococum和一些硅藻都能产生β-胡萝卜素、叶黄素、角黄素、虾青素和岩藻黄素[171,185,195,196]。
绿色微藻小球藻以其作为补充营养和在其生物量中具有高蛋白和叶绿素含量而闻名。在这种微藻中还记录到大量具有良好生物利用度的叶黄素、β -胡萝卜素和玉米黄质(分别为1.18 mg g - 1、0.31 mg g - 1和0.24 mg g - 1)[197]。据报道，在异养条件下，小球藻菌株产生叶黄素(初级类胡萝卜素)的有趣结果[198]。特别是，从异养培养中提取了高达5.3 mg g - 1的叶黄素，在混合营养培养中提取了约7.5 mg g - 1[199,200]。叶黄素的产生和培养基的选择可能取决于菌株和培养条件:对于C. protothecoides和C. pyrenoidosa，在异养条件下，葡萄糖是首选，而在光养条件下，叶黄素增加最多的是醋酸。
Dunaliella salina是一种主要产生β-胡萝卜素的绿色单细胞微藻，也可以被认为是一种强大的类胡萝卜素生产者。在这种微藻中，色素开始在细胞一侧的脂质结构中积聚，并最终充满整个细胞。
绿色微藻Asterarcys quadricellulare是一种潜在的类胡萝卜素良好生产者，可以通过调节培养基组成、pH、盐度、光照质量、强度和持续时间来提高类胡萝卜素的合成[201]。每干克生物量产生的β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素和角黄素含量分别为47.0、28.7、15.5和14.0。
田葵可以产生大量的叶黄素，叶黄素可以使细胞从绿色变成黄色，而且是抗氧化剂类胡萝卜素的重要来源。从土耳其卡普卢卡亚水库(Kırıkkale)分离到的一株斜葡萄树菌株可产生大量的类胡萝卜素，主要为叶黄素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、玉米黄质、顺式新黄质、9或9′-顺式α-胡萝卜素、13或13′-顺式叶黄素、13或13′-顺式β-胡萝卜素、9或9′-顺式叶黄素、顺式叶黄素、9或9′-顺式β-胡萝卜素，类胡萝卜素含量较高，其中以叶黄素和β-胡萝卜素的全反式异构体含量最多。占总类胡萝卜素的83.74% (2.52 mg g−1)[202]。这些结果很有趣，因为它们表明，有各种各样的微藻可能被认为是天然化学物质的宝贵来源。
2.3 主要enviro影响初级类胡萝卜素生产的心理因素
光合链的过度还原和自由基的产生是由影响生长和光合效率的变量引起的。最佳营养成分和光照强度、pH值、盐度和温度的最佳值是根据菌株、物种和来源而变化的一些参数。在这些参数中，一个至关重要的参数是光强度。光合系统有各种生理限制，阻止它利用超过一定强度的光照射。尽管是积累抗氧化化合物的有效方法，但通过暴露于强光、营养限制-饥饿、过低或过高温度或盐度胁迫等胁迫条件来诱导类胡萝卜素的合成，就生物量生产力而言是不合适的，因为在这些情况下生长受到严重影响。
2.3.1 光强度
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作为研究光合作用生理生化的模式生物，在这方面的研究中得到了广泛的应用。在这种微藻中，暴露于800 mol光子m−2 s−1的10分钟内就能触发玉米黄质的产生，而在300-350 mol光子m−2 s−1的条件下可以部分诱导这个循环[177,203,204]。
随着另一个叶黄素循环的激活，通过二氧芑质的去环氧化合成二氧芑质，微藻细胞迅速对过度的光强作出反应。在三角草中，二氧芑质转化为二氧芑质非常快，因为它可以在暴露在阳光直射下的室外培养中发生，只需15分钟。
叶黄素是强抗氧化剂类胡萝卜素之一，据报道在强光条件下会增强。作为一种主要的类胡萝卜素，这种色素天然存在于大多数光合细胞中，在光氧化应激条件下，其产量可能会增加。在1900 mol光子m−2 s−1和35°C的条件下，室外管状光生物反应器中的微藻Scenedesmus almeriensis产生了极高水平的叶黄素(约5 mg m−2 d−1)[205]。高光和高热同时存在是造成这种增加的原因。事实上，这种微藻菌株通常在25至28°C之间的温度下生长得最好。
另一种关键的类胡萝卜素的含量通常会随着光照的增加而增加，它是β-胡萝卜素，它自然存在于微藻细胞中，但在某些条件下可能会过度合成。
在以这种分子的良好生产者而闻名的微藻中，杜氏盐藻无疑是最有前途的之一。在实验室环境中，在30°C的光照强度为200-1200 mol光子m−2 s−1的条件下，有报道称产率为13.5 mg−1 d−1[206]。
对一株Tetraselmis sp.的研究表明，在170µmol光子m−2 s−1的光强下，叶黄素和β-胡萝卜素含量分别增加到干重3.17和3.21 mg g−1[207]。除了光胁迫外，该菌株还经受了30°C的高温，显示出适合在极端条件下培养的耐热性。
2.3.2 营养限制或饥饿
硫对于维持蛋白质合成至关重要，因此硫的缺乏或限制会导致蛋白质含量急剧下降，进而影响光合作用活性并减缓发育。在闭式光生物反应器中，由于光合出氧量的下降和氧呼吸的存在，可能会形成极低的氧含量甚至厌氧条件，这是一个很强的还原环境[208]。微藻C. reinhardtii因其在没有硫的情况下产生氢的能力而成为许多研究的主题。有趣的是，黄素循环被强烈诱导，花青素、玉米黄质和紫黄质水平显著增加。其他叶黄素，叶黄素和β-胡萝卜素的含量也增加了[177]。此外，厌氧也会在更长的时间内引起相同的反应，但在一个完整的培养基中(5小时，而不是几分钟)。在有氧条件下，花青素和玉米黄质以及叶黄素和β-胡萝卜素下降，表明出现了恢复。
硫的限制或剥夺诱导了纳米绿opsis gaditana的叶黄素循环，如氮的情况下所见，紫黄质和玉米黄质增加[209]。
由于氮是蛋白质和酶的重要组成部分，培养基中缺乏这种营养物质会严重影响生长和生物量组成。杜氏藻在强光照射条件下产生β-胡萝卜素的能力因氮剥夺而增加。氮饥饿和暴露于200 mol光子m−2 s−1光强的组合诱导β-胡萝卜素增加，达到生物量的2.7%的水平[210]。
在严重的光胁迫和缺氮条件下，这种色素的增加与总脂肪酸的产生有关[211]。这种类胡萝卜素的产生与脂肪酸的生物合成途径密切相关，这可能是由于β-胡萝卜素储存在脂质球中。这个元素非常有趣，并证明了微藻的代谢途径是如何密切相关的，以提供对压力源的有效和高效的反应。
氮限制或氮剥夺诱导了纳米绿藻叶黄素循环，导致紫黄质和玉米黄质增加。在[209]中，细胞在完全培养基上培养后经历了硫限制或饥饿，以产生相当数量的生物量。在这种情况下，生物量中的叶黄素色素得到了增强。考虑到这种色素通过花青素参与玉米黄质的形成，紫黄质的上升不那么明显。高诱导类胡萝卜素的合成是其增加的信号，这表明紫黄素的重新合成。
磷在DNA、RNA和磷脂的细胞组成以及酶活性、代谢途径和ATP合成的控制中起着至关重要的作用。它可以以多磷酸盐或正磷酸盐的形式提供，在培养基成分中加入它可以确保有效的光合活性[212]。
限制或剥夺磷可诱导纳米绿opsis gaditana的叶黄素循环，如氮的情况所示，紫黄质和玉米黄质增加[209]。
2.3.3 盐胁迫
盐胁迫是影响微藻发育和产量的最重要的非生物变量之一。一些微藻已经发展出适应盐水环境的方法，在这些不利的环境中，它们可以控制渗透调节化学物质的产生，帮助细胞应对压力。特别是，渗透胁迫可引起叶绿体和细胞膜中各种极性脂质的浓度升高，如糖脂和磷脂。如前所述，几种类胡萝卜素依赖于脂质生成来放置，通常，脂质生成与类胡萝卜素的合成密切相关。
事实上，过量的Na+和Cl−离子降低了环境的渗透势，从而减少了水的摄入量，导致光合物种在盐胁迫下发生了广泛的生物能和生化变化。盐胁迫对微藻细胞的影响在几个层面上导致修饰和影响，包括膜通透性的改变，离子稳态的阻断，脂质和生物聚合物分解代谢的增加，以及能量产生活性的改变。
盐胁迫可以作为一种促进类胡萝卜素合成的策略，因为像其他应激源一样，盐胁迫可能对微藻培养物的生长速度产生重大影响，也会降低光合活性。NaCl浓度的增加抑制了zoofingiensis的生长，而类胡萝卜素的数量增加[213]。
文献[214]报道了其对叶黄素产生的影响。结果表明，在不同的盐胁迫水平下，35 ppt的盐胁迫诱导叶黄素含量增加最多(11.36 mg g−1)。[215]还研究了强光和盐胁迫对Scenedesmus sp.的影响。作者报道了在160µmol光子m−2 s−1的条件下，NaCl浓度为156 mmol L−1，叶黄素产量为6.45 mg g−1。在10 g L−1 NaCl条件下生长的一株花椰菜中，观察到类胡萝卜素含量增加，尤其是叶黄素成分[216]。
根据[217]，在0.34 ~ 0.51 M范围内的盐胁迫会导致C. vulgaris生长速率下降。这种下降可能与离子平衡失衡有关，这种失衡降低了光合活性，影响了参与渗透调节的光利用和碳水化合物代谢，并导致活性氧积累。与氮、硫或磷限制一样，这被认为是诱导类胡萝卜素合成的催化剂，因此在这种情况下，低生物量生产力也可能与高类胡萝卜素产量有关。
2.4 微藻细胞中类胡萝卜素的提取
从微藻中提取类胡萝卜素采用传统的有机溶剂萃取技术。要提取的类胡萝卜素的极性、溶解度和化学稳定性决定了传统的提取方法是使用有机溶剂还是水溶剂。
根据目标类胡萝卜素的极性，可采用非极性溶剂(正己烷、二氯甲烷、二甲醚、乙醚)或极性溶剂(丙酮、甲醇、乙醇、各种有机溶剂的双相组合)。
为了从微藻中回收类胡萝卜素，研究了使用绿色溶剂(环保无毒溶剂)，如乙醇、柠檬烯和水与有机溶剂的双相混合物。由于制造成本高和广泛的溶剂使用，从微藻中提取类胡萝卜素的经济可行性目前很低。
因此，最近人们对使用非常规开采技术的兴趣越来越大。这些非常规萃取技术具有萃取时间短、溶剂用量少、回收率高、选择性高等优点[218,219,220,221,222,223,224,225,226]。简要介绍了常用的提取方法。
2.4.1 微波辅助萃取
由于微藻细胞壁中存在藻聚糖和孢子孢粉，因此分解微藻细胞可能是一项具有挑战性的任务[224]。此外，传统的细胞破坏和提取方法效率较差。当微波辐射以接近2.45 GHz的频率使用时，极性分子振动，导致分子间和分子内摩擦。
对两种海洋微藻Dunaliella terolecta(绿藻门)和cydrotheca closterium(硅藻门)进行了微波辐射提取色素的研究。[219]研究了这种方法与传统方法相比的有效性。所有的技术都能快速提取三叶草色素。结果表明，最佳提取方法为MAE，具有提取速度快、重复性好、加热均匀、提取率高等优点。
2.4.2 超声辅助提取(UAE)
阿联酋是基于超声空化。采用高强度、低频率的超声波进行超声提取。低强度-高频(100 kHz - 1 MHz)和高强度-低频(> 1 MHz)超声可以彼此区分(20-100 kHz)。阿联酋是负担得起的，它大大缩短了提取时间，提高了提取产量。
利用超声辅助从微藻Arthrospira platensis中提取每g干重4.66 mg β-胡萝卜素[38]。为了增强提取，调整了几个参数(振幅、占空比、超声周期和浸泡在溶液中的喇叭深度)。
从该藻类中提取β-胡萝卜素的最理想参数为80%振幅，33%占空比，0.5 cm角深度，超声作用10 min。用UAE法提取小球藻中的叶黄素、β -胡萝卜素和α-胡萝卜素也有研究[227]。最高提取量分别为干重生物量4.844±0.780、0.258±0.020和0.275±0.040 mg g−1。
2.4.3 亚临界流体萃取
亚临界流体萃取采用液化的亚临界流体作为萃取溶剂。与超临界流体萃取相比，亚临界流体萃取在相对温和的温度和压力下进行。此外，使用乙醇修饰亚临界1,1,1,2-四氟乙烷，可以有效地提取类胡萝卜素和叶绿素-a[170]。
2.4.4 Electrotechnologies-assisted提取
包括脉冲电场(PEF)、中等电场(MEF)和高压放电(HVED)在内的电子技术是其他非热和环保的提取方法，用于从生物悬浮液中提取细胞内的化学物质。
以毫秒(5 kV/ cm-40 ms)或微秒(20 kV/ cm-75 s)脉冲提取小球藻类胡萝卜素的效率提高80%。当MEF和乙醇作为溶剂(180 V, 75 mL/100 mL乙醇溶液)时，微藻黄体异小球藻的类胡萝卜素提取率高达73%[228]。
2.4.5 加压液体萃取(PLE)
使用PLE的主要好处是它可以快速提取，同时消耗更少的溶剂。在PLE中，溶剂是在压力和温度条件下提取的，总是低于临界点。
用PLE法从冻干的巨藻和微藻生物质中提取类胡萝卜素。加压液体萃取在三角褐指藻中产生了非常高的岩藻黄素提取率，高达26.1 mg g−1 DW[229]。以Neochloris oleoplentians为例，采用加压液体萃取法回收生物活性类胡萝卜素叶黄素、类胡萝卜素单酯和紫黄素[230]。
与浸渍法、索氏提取法和超声辅助提取法相比，加压液体提取法(PLE)对绿色微藻小球藻(Chlorella vulgaris, UAE)中类胡萝卜素和叶绿素的提取效率更高[231]。
2.4.6 高压均质(HPH)处理和酶辅助提取
由于微藻细胞不易被破坏，提取前的物理或酶预处理有助于恢复类胡萝卜素。其中一种方法是HPH，它利用高强度流体应力(50 - 400mpa)导致细胞破裂。与传统的物理铣削方法相比，它具有重要的优势，包括使用简单、商业可行性、可重复性和高通量[170]。
2.4.7 超临界流体萃取
SFE包括利用超临界流体或温度和压力高于其临界极限的流体的萃取。超临界流体由于其低粘度和高扩散率，具有比液体更好的溶剂化和输运特性。
SFE用于在250 bar和60°C条件下使Scenedesmus obliquus产生最大的类胡萝卜素[232]。
2.5 类胡萝卜素的纯化
为了确保类胡萝卜素在到达消费者手中时保持其品质，在提取类胡萝卜素的过程之后，还需要进一步的方法。这些策略包括纯化感兴趣的化合物，去除任何剩余的细胞碎片，并保留分子[233]。从微藻中获得的类胡萝卜素与从其他天然来源中获得的类胡萝卜素一样纯净。Willstatter技术是纯化类胡萝卜素的传统方法的基础[180]。
为了防止产品降解，这种纯化方法在低温(低于60°C)下使用盐(NaOH或KOH)作为皂化剂，然后使用有机溶剂(如己烷或乙醇、水和二氯甲烷的混合物)，然后将其除去，以获得所需的类胡萝卜素产品。这种耗时的纯化方法目前正在被几种色谱方法所取代，这些方法已经在许多出版物中进行了编译和深入讨论[234,235]。
类胡萝卜素被提取和纯化后，空气、光或热可能导致最终产物降解[180]。提取后考察了叶黄素、番茄红素、玉米黄质、α和β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质等类胡萝卜素标准溶液的稳定性。除番茄红素外，这些研究发现类胡萝卜素标准溶液(0.05-5 g mL - 1)不降解，可在- 70°C下保存6个月[236,237,238]。
2.6 一些最具代表性的初级类胡萝卜素的应用
类胡萝卜素在医疗保健和制药行业需求量很大，因为它们是维生素A原，具有强大的抗氧化特性(表5)。
例如，经常食用9-(Z)新黄质可以降低患肺癌的几率[241]。
紫黄质及其衍生物已被证明具有有效的脂质过氧化抑制特性，并在文献中报道具有抗氧化作用[242]。此外，采用2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)和2,2-偶氮-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)自由基试验来证明从微藻Eustigmatos cf. polyphym中提取的紫黄质清除自由基的特性[176]。
在眼科领域，玉米黄质起着重要的作用。它保护视觉器官免受近紫外线的伤害，并降低与年龄相关的黄斑变性的风险，并且自然存在于眼睛的中央黄斑中[243]。它作为一种天然染料的潜力表明了它在食品中的应用，在化妆品中作为抗氧化剂，以及在鱼和家禽的着色中[244]。据报道，玉米黄质有益于治疗心血管疾病，并可能有助于糖尿病患者发展为胰腺癌和肺癌[245]。这种叶黄素有助于辅助治疗，因为它可以导致黑色素瘤细胞凋亡。
番茄红素具有抗氧化和光防护特性。它在人类结肠、乳腺、前列腺、肝脏和淋巴细胞系中具有抗癌特性[246]。它通过增强内皮功能和减少氧化应激来对抗高血压问题和早期关节硬化。番茄红素通过类似于他汀类药物的降血脂作用维持血液胆固醇水平[247]。每日剂量的番茄红素加强骨骼系统，改善间隙连接的细胞间连接，并维持葡萄糖稳态。根据[246]，番茄红素诱导的肿瘤转移被抑制是由于调节细胞周期进程的结果。
一项对高胆固醇大鼠的体内研究发现，与从番茄中提取的洛伐他汀和反式番茄红素相比，从小球藻中提取的藻类番茄红素具有更强的抗氧化和抗炎作用。
虽然在工业水平上，万寿菊是叶黄素生产的主要来源，但许多微藻菌株能够生产相当数量的叶黄素[248]。需要考虑的一个关键方面是，虽然金盏花中的叶黄素是酯化的，但它在微藻中以游离形式存在，比酯化形式更容易被吸收[249]，对人类健康有各种好处:抗氧化、滤光和抗炎活性、保护眼睛、对许多慢性疾病的潜在治疗益处、降低癌症风险。
抗氧化剂叶黄素可以保护眼睛、大脑和皮肤免受伤害。像玉米黄质一样，它可以保护眼睛免受有害的紫外线和蓝光的伤害，因此被称为“眼部维生素”。它通过降低血浆因子d的含量来预防老年性黄斑变性和白内障，它也是一种有效的化疗药物[250]。它是一种积极对抗前列腺癌、乳腺癌和结肠癌的化学物质。食用叶黄素还可以降低患肺癌和早期动脉粥样硬化的风险。它减轻了由炎症引起的神经退行性疾病的后果。它广泛用于鸡肉中作为羽毛着色剂，蛋黄颜色增强剂，并作为婴儿食品，药品和化妆品的添加剂。
众所周知，β-胡萝卜素具有抗炎、抗氧化、免疫、皮肤、肝和视网膜保护等特性[251]。这种色素广泛用于化妆品和食用色素行业[241]。据说这种色素对乳房、结肠、肺、肝和皮肤的恶性肿瘤有保护作用。
β-胡萝卜素可维持细胞凋亡、细胞分化和增殖，并可改善间隙连接细胞间通讯，减轻H2O2对细胞间通讯的不利影响[244]。经常在饮食中加入它可以预防肝纤维化和夜盲症。
2.7 市场
据估计，2016年全球类胡萝卜素市场价值为12.4亿美元，2021年为15.3亿美元[252]。它们的全球经济价值是由消费者需求和开采成本决定的。
饲料、食品和饮料制药、化妆品、水产养殖和营养保健行业是重要的类胡萝卜素细分市场[253]。在全球范围内，预计市场规模为15亿美元;然而，由于需求强劲，预计到2022年将增加到20亿美元，复合年增长率(CAGR)为5.7%。由于用途多样，β-胡萝卜素、叶黄素、岩藻黄质和玉米黄质主导市场。目前，叶黄素的主要商业来源是万寿菊，然而，微藻生物量每单位干物质中叶黄素的含量是其3 - 6倍。BCC Research在全球类胡萝卜素市场的报告中报道[170]，β-胡萝卜素占2.462亿美元(占总量的17%)，叶黄素占2.25亿美元(占总量的15.6%)，番茄红素占1.07亿美元(占总量的7.4%)。
由于其需求，预计到2022年，叶黄素的市场价值将从2017年的2.638亿美元增加到3.577亿美元(比2016年复合年增长率为6.3%)。相反，市场上β-胡萝卜素的价格根据需求和类胡萝卜素纯度的不同，估计在300-1500美元/公斤左右[254]。
到2023年，饲料行业将在全球类胡萝卜素市场中占据最大的市场份额，这是由于限制性法规减少，同时考虑到肉类、家禽和乳制品生产的增长，这将加速饲料业务的扩张。
关于欧洲国家类胡萝卜素的大规模生产，Ambati等[252]解释说，欧洲类胡萝卜素市场的扩大可能受益于印度斯坦联合利华、欧莱雅、汉高、拜尔斯道夫等知名化妆品公司的投资和参与。
用微藻生产可持续且具有经济优势的类胡萝卜素的瓶颈在于缺乏上游(提取)和下游(净化)工艺的原材料、有效的仪器和技术，这些都有助于实现高货币价值[255]。此外，类胡萝卜素的市场受到与保健、环境和动物有关的法律和严格规定的限制。然而，由于对天然产品的需求增加和传统资源的枯竭，大公司正在大力投资类胡萝卜素生产，以提高其在类胡萝卜素市场的竞争力。表6报告了从事类胡萝卜素商业化和生产的一些主要公司。
