摘要
背景
建立了二花丛鹅毛Linum suffruticosum的微卫星标记，并在单态姊妹种鹅毛Linum tenuifolium中进行了微卫星标记试验。这些种分别是地中海西部和西北部特有的多年生草本植物，分布区域部分重叠。
方法与结果
利用下一代测序技术开发了12个微卫星标记，并对7个自然居群152个个体的多态性和遗传多样性进行了分析。标记多态性较高，每个位点和群体有2 ~ 16个等位基因，平均观察杂合度和预期杂合度分别为0.833和0.692。所有的基因座在姐妹种L. tenuifolium中均扩增成功，并从7个种群中筛选了150个个体。多态性较高，每个位点和群体有2 ~ 10个等位基因，平均观察杂合度和预期杂合度分别为0.77和0.62。
结论
在L. suffruticosum中鉴定的微卫星标记和在L. tenuifolium中检测的微卫星标记，为进一步研究两种Linum在接触区群体遗传、交配模式和杂交提供了有力的工具。
介绍
Linum L. (Linaceae)是一种世界性、多样性的属，具有重要的经济和生态意义。此外，从达尔文的早期观察[1]到s位点基因组学的最新进展[2]，它是研究异种进化的模型系统。异质花柱是指在一个种群中同时存在两到三种花型，其中花型(1)是雌雄同体的，(2)在花的不同位置呈现柱头和花药[3]。Linum在形态、交配系统、异花柱和相关花型多态性方面表现出高度变异，这些变异经历了多次独立的进化[4,5,6]。
姐妹种Linum suffruticosum和L. tenuifolium(图1)似乎是一个理想的研究系统，可以评估支持Linum异质性维持和丧失的微进化机制[7,8]。Linum suffruticosum分布在地中海盆地西部，是一种异型自交不亲和的物种，具有独特的三维异型[8]。自亲和性单形态的L. tenuifolium是L. suffruticosum的姐妹种，分布在欧洲南部[6,9,10]。在地中海盆地的西北部，从西班牙东北部到意大利西北部，这两个物种都有一个接触带，种群在附近的地点共同出现，甚至杂交并能够杂交[10]。这个接触区使L. suffruticosum-L。Tenuifolium复合体是一个很好的系统，可以解决交配系统进化的问题，并了解生殖隔离和物种分化的潜在过程[11]。
二花束状的亚麻(左)和花柱单形的亚麻(右)的花，以及它们的性器官和两种常见传粉者的细节
在过去的二十年中，简单序列重复标记(SSR)由于其共显性遗传模式和高度多态性的性质，已成为分子生物学中从基因组定位到种群和生态遗传学等各种应用中最常用的工具[12,13]。SSR标记通常用于研究特定物种的遗传变异[例如14,15]。然而，当基因组资源无法用于从头发育时，SSR标记也可以在近亲物种之间转移[例如16,17]。
迄今为止，用于亚麻种群研究的分子工具的发展大多局限于栽培亚麻L. usitatissimum[18,19,20]，这意味着缺乏合适的分子资源来研究几种野生亚麻物种的进化生态学。在此，我们研究了12个新的多态微卫星位点，以及它们在每个物种的7个野生居群中对L. tenuifolium的转移性。这些标记将为今后的遗传、交配模式的研究以及接触区姐妹种内和姐妹种之间潜在的自然杂交提供参考。
材料与方法
SSR候选位点的鉴定及引物设计
从一个自然种群(Prat d 'Aguiló， Lleida, Spain;42.34301, 1.71806)与Invisorb®旋转植物迷你套件。DNA被传送到Ecogenics GmbH (schliren - z
引物检测及多态性评价
利用分布在接触带的L. suffruticosum和L. tenuifolium各7个居群共302个个体进行引物检测和多态性分析(在线附录1)。叶组织采集于彼此间隔至少1 m的个体，并在硅胶中保存。在L. tenuifolium和L. suffruticosum中，营养生殖分别可以忽略不计或非常有限。一些种群位点为纯种群，而另一些种群位点为混合种群，这两种种群均可明显区分(图1和在线附录1)。在其分布范围内，细叶Linum tenuifolium被描述为二倍体物种，尽管L. suffruticosum是多倍体复合体，但所有筛选的种群均为二倍体[25]。
随机选取60个微卫星，在每个种和种群的2-4个个体(共96个个体)中进行扩增试验。用ISOLATE II Plant DNA Kit (Bioline)提取基因组DNA。采用20µL的主液进行PCR扩增，主液包括:1x MyTaq Red Reaction Buffer (Bioline)、各0.4 μm的正向和反向引物、0.01%的牛血清白蛋白(BSA, Promega)、0.5 u MyTaqTM Red DNA Polymerase (Bioline)、50-70 ng gDNA和20µL的去离子水。在94°C下对所有初始变性2分钟的基因座进行触地处理;然后进行10次循环，在92°C下30秒，在63°C下30秒，每循环增加- 1°C，在72°C下30秒;然后进行20次循环，94°C 30 s, 56°C 30 s, 72°C 30 s;在72°C下延长5分钟。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中扩增。选择12个在两个物种中均扩增良好的标记(表1)进行多态性评估。
前向引物分别用6-FAM、VIC、NED或PET荧光标记进行片段分析，每个物种和种群共有18-24个个体(302个个体);DNA提取和PCR反应采用与引物检测相同的程序进行。PCR产物在ABI 3730全自动毛细管DNA测序仪(英国邓迪大学测序服务公司)上进行分析，使用GeneScan 500 LIZ内部尺寸标准。在genous (Biomatters)中进行等位基因的生成和调用。
对于每个基因座和群体，利用R包popgenreport的popgenreport函数计算每个基因座的等位基因数(A)、观察杂合度(HO)和期望杂合度(HE)[26]。每个基因座与Hardy-Weinberg平衡的偏差使用函数mk.hw进行测试。根据Brookfield[27]和Chakraborty等人[28]的方法，用null函数检验null等位基因的存在。
目录
摘要 介绍 材料与方法 结果与讨论 数据可用性 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 ＃＃＃＃＃结果与讨论
本研究利用新一代测序技术建立了亚麻(Linum suffruticosum)基因组文库，对12个SSR标记进行了鉴定，并对其在姐妹种L. tenuifolium上的可转移性进行了测试。12个SSR标记在每个被评估种的7个群体中扩增并显示出高水平的多态性。所有微卫星区域均被存入NCBI Genbank(表1)。
L. suffruticosum的等位基因数量为2 ~ 16个，平均为6.7个;观察到的杂合度(HO)范围为0.09 ~ 1，平均为0.83;期望杂合度(HE)在0.45 ~ 0.9之间，平均为0.69(表2)。在每个群体中，经Bonferroni校正后，有4 ~ 9个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡，有2 ~ 4个位点存在零等位基因(表2)。在柽柽花中，每个群体每个位点的等位基因数(a)在2 ~ 10之间，平均为5.1;观察到的杂合度(HO)范围为0 ~ 1，平均为0.77;期望杂合度(HE)在0.05 ~ 0.88之间，平均为0.62(表3)。在每个群体中，经Bonferroni校正后，有5 ~ 12个位点明显偏离Hardy-Weinberg平衡，2 ~ 4个位点显示存在零等位基因(表3)。我们发现遗传多样性水平高，且显著偏离Hardy-Weinberg平衡。这与三维异花柱L. suffruticosum固有的异交以及所分析群体中两个分类群之间潜在的杂交是一致的。
这些SSR标记将为研究柽柳与柽柳接触带内的交配模式、纯居群和混居群内的基因流动模式和空间遗传结构提供有用的工具。从宏观进化模式[5,6]到Linum物种和种群内部或之间的更精细尺度过程[2,29]，以及多倍体[25,vald
补充信息
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