摘要

目的

肠道细菌代谢胆汁酸(BA)与胃肠道疾病风险相关;此外，其控制已成为治疗代谢性疾病的现代策略。本横断面研究调查了67名社区青年参与者的排便状态、肠道微生物群和习惯饮食对粪便BA组成的影响。

方法

收集粪便进行肠道菌群和BA分析;分别采用布里斯托大便量表和简易自我管理饮食史问卷收集排便状况和饮食习惯数据。根据聚类分析，参与者根据粪便BA组成分为四类，根据脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)水平分为四类。

结果

粪胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)水平较高的初级BA (priBA)群正常粪便频率最高，粪胆酸和鹅去氧胆酸(CDCA)水平较高的二级BA (secBA)群正常粪便频率最低。另外，高priba集群具有明显的肠道微生物群，具有较高的Clostridium subcluster XIVa和较低的Clostridium cluster IV和Bacteroides。粪便DCA和LCA水平低的低secba群动物脂肪摄入量最低。然而，高priba组的不溶性纤维摄入量显著高于高secba组。

结论

高粪CA和CDCA水平与不同的肠道微生物群有关。相反，高水平的细胞毒性DCA和LCA与动物脂肪摄入量增加、正常粪便和不溶性纤维摄入量减少有关。

临床试验注册

大学医院医疗信息网络中心系统(UMIN000045639);报名日期:15/11/2019。

介绍

原胆汁酸(priBAs)——包括胆酸(CA)和鹅脱氧胆酸(CDCA)——由人体肝脏中的胆固醇合成，与牛磺酸或甘氨酸结合，分泌到肠道中，在肠道中溶解膳食脂质[1]。结合的priba随后在回肠末端被重新吸收并返回肝脏[2]。一些共轭priba可被肠道细菌逐步修饰[3]。肠道细菌借助于胆盐水解酶活性将priba解偶联为游离priba[4]，然后将游离priba转化为各种次级BAs (secBAs)[2]。肠道BA代谢与多种疾病的发生和进展有关[5,6]。因此，调节肠道BA代谢可能成为预防或治疗多种疾病的新策略[7]。

肠道细菌通过7α-去羟基作用将CA和CDCA分别转化为脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)，这是人类大肠中主要的BAs[2]。DCA和LCA具有潜在的遗传毒性和促肿瘤作用[8]。它们的增加也与结肠癌[9]、胆石症[10]和肝癌[11]的风险增加有关。另外，由于BAs通过法脂类X受体调节脂质和葡萄糖代谢，使用抗生素抑制secBA的产生可降低血清甘油三酯和葡萄糖水平[12]。益生菌也可能有助于降低血清胆固醇水平[13,14]，因为粪便排泄增加。这是通过增加游离priBA的产生和回肠末端的低重吸收来实现的[15]。然而，这一理论存在争议，因为游离priba可能在结肠内进一步转化为有毒的secba[16]。此外，结肠中BAs暴露增加可能通过促进液体和电解质的分泌而与腹泻有关[17]。另一方面，肥胖患者体内主要产生胆盐水解酶的拟杆菌门(Bacteroidetes)含量较低[18][19]。此外，具有7α-去羟化活性的细菌所属的Clostridium亚群XIVa水平低与肠道生态失调有关[20]。虽然BAs可被肠道细菌修饰，但各种细菌菌株的相对丰度如何影响人体健康仍不清楚[21]。

饮食是一个可改变的因素，可以影响排便状态[22]、BAs[23]和肠道菌群[24,25]。排便状态、BAs和肠道微生物群可能相互作用[17,20,26,27]。鉴于各种BAs与疾病预防或治疗之间已知的关联，我们试图澄清饮食、排便状态、BAs和肠道微生物群之间存在的关系。不幸的是，很少有研究调查了所有这些因素。此外，利用动物模型进行的BA研究受到人类与非人类动物之间已知差异的限制[28]。其中，大鼠的主要priba是CA和β-胆酸;而在人类中，主要的priba是CA和CDCA。因此，人体研究可能更相关。本横断面研究通过检查社区居住的年轻参与者的粪便BA组成，确定了排便状态、肠道微生物群和饮食之间的关系。

方法

研究参与者

该研究的参与者是山形县米泽营养科学大学或Sakura no Seibo初级学院的70名学生。两名在粪便取样前一周服用过腹泻或便秘药物的参与者被排除在分析之外。此外，在聚类分析中，我们排除了不适合任何聚类的第三个参与者。因此，67名参与者被纳入分析(5名男性，62名女性;年龄在18到22岁的)。所有参与者均提供书面知情同意书;研究方案经山形县米泽营养科学大学伦理委员会批准(批准号2019-9)，研究方案符合《赫尔辛基宣言》。

协议

参与者每人接受一次以下检查:(A)记录粪便收集前一周的排便状况和益生菌食物消耗情况，(B)粪便收集，(C)使用简短的自我管理饮食史问卷(BDHQ)进行饮食评估[29,30]。参与者被要求在研究期间继续他们的日常生活，不要对他们的一般饮食或体育活动做出任何重大改变。

记录排便状况及益生菌食物

参与者在收集粪便前一周使用布里斯托尔粪便量表(BSFS)记录他们的排便状况。BSFS是一种将粪便形态分为7类(1-2类为硬质粪便，3-5类为正常粪便，6-7类为含水粪便)的工具。该工具广泛应用于临床和研究领域[31,32]。研究人员对参与者进行了有关BSFS的指导，并要求他们在排便后立即对粪便进行自我评估和记录。他们还被要求记录在此期间食用的益生菌食品(定义为含有乳酸菌和双歧杆菌的食品)。这些记录一直保存到收集粪便为止。

收集和分析粪便

我们要求参与者在记录一周的肠道运动和益生菌食物摄入后，在方便的时候收集他们的粪便。按照指示，参与者立即将所有排便的粪便收集到一个特殊的粪便收集杯中，用勺子搅拌几次，然后将收集杯放入一个容器中，然后将容器放入一个装有冷却剂的冷袋中。参与者还使用BSFS评估他们收集的粪便。参与者将袋子尽快提交给研究人员(即工作日清晨采集的样本在早上提交;在校园收集的样本及时提交;如果样本是在假期或晚上收集的，参与者联系研究人员，然后研究人员在参与者的家中取样本)。提交的粪便样本保存在- 80°C直到使用。

我们由Techno Suruga Laboratory Co.， Ltd (Shizuoka, Japan)使用针对细菌16S rDNA的末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析了粪便微生物群。根据先前发表的方案[33]从粪便样本中提取DNA。简单地说，将每个粪便样品100 mg悬浮在4 M胍硫氰酸酯、100 mM Tris-HCl (pH 9.0)和40 mM EDTA中，然后使用FastPrep-24 5G仪器(MP Biomedicals, USA)用氧化锆珠打匀，获得粗提取的DNA。使用自动DNA分离系统(GENE PREP STAR PI-480, Kurabo Industries, Japan)和DNA分离试剂盒(NR-201, Kurabo Industries, Japan)纯化DNA。我们使用NanoDrop ND8000 (Thermo Ficher Scientific, USA)估计DNA浓度，并将最终DNA样品浓度调整为10 ng/μL。我们根据先前发表的方案进行了16S rDNA扩增、限制性内切酶酶切和片段分析[34,35]。使用荧光标记的516f引物(5 ' -TGCCAGCAGCCGCGGTA-3 ')和1510r引物(5 ' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ')扩增16S rDNA，用FastDigest BseLI (BslI, Thermo Fisher Scientific, USA)酶切10分钟。酶切产物通过ABI PRISM 3130xl基因分析系统(Applied Biosystems, USA)进行片段分析。梭状芽孢杆菌的分类学由Collins等人提出[36,37]。

我们使用液相色谱法结合混合四极杆飞行时间质谱法(LC-QTOF-MS)分析了日本静冈市Techno Suruga实验室株式会社的粪便BA浓度。使用先前描述的方法[38]从粪便样本中提取BAs，并进行了轻微修改;每个粪便样品取100 mg悬浮在0.9 mL醋酸钠缓冲液(100 mM, pH 5.6)与乙醇混合中，使用2ml带有氧化锆珠的管，然后在85℃下加热30分钟。在18,400×g离心10分钟后，将上清用水稀释4倍，使用Bond Elut C18滤筒(Agilent Technologies, USA)进行固相萃取。将得到的提取物蒸发溶剂，将残留物用50%乙醇内标溶解。该溶液通过亲水性聚四氟乙烯过滤器过滤，并作为LC-QTOF-MS分析的样品。LC-QTOF-MS仪器由Waters ACQUITY UPLC、Xevo G2-S QTOF和电喷雾电离探针(Waters, USA)组成。采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7µm, 2.1 × 150 mm, Waters, USA)，温度65℃。梯度洗脱采用0.1%甲酸水溶液(溶剂A)和含有0.1%甲酸的乙腈(溶剂B)，流速为0.5 mL/min。溶剂B的梯度洗脱程序为:0-0.5 min, 30%;0.5-1.0 min, 30-35%;1.0-7.0 min, 35-40%;7.0-10.0 min, 40-50%;10.0-11.5 min, 50-95%;11.5-13.0 min, 95%。QTOF质谱仪在负离子模式下工作。脱溶气体为氮气，碰撞气体为氩气，使用的参数为:毛细管电压0.5 kV;采样锥电压，20 V;源温度:150℃;脱溶温度:450℃;锥形气体流量，100 L/h;脱溶气流量，1000l /h;扫描时间，0.3 s;数据采集区域，50 - 850m /z。以亮氨酸脑啡肽为锁质，产生554.2615 Da [M-H]-离子。

习惯性饮食的评估

我们使用BDHQ评估参与者在前一个月的饮食[29,30]。该问卷主要基于日本食品成分标准表，由日本文部科学省制定[39]，询问被调查者消费58种不同食品和饮料的频率。一种商用计算机算法被用来计算营养摄入量。由于BDHQ能够对许多营养素的能量调整摄入量进行排名[29,30]，因此每个参与者对各种食物的消耗以每1000 kcal的密度表示。

分类英航根据粪便中的碱基组成

本研究采用聚类分析和分类分析相结合的方法，对研究对象的粪便BAs组成进行了分类。我们分析的17种BA浓度进行了随后的聚类分析[包括5种游离BAs (CA、CDCA、DCA、LCA和熊去氧胆酸(UDCA))， 5种甘氨酸偶联(G-) BAs (G-CA、G-CDCA、G-DCA、G-LCA和G-UDCA)， 5种牛磺酸偶联(T-) BAs (T-CA、T-CDCA、T-DCA、T-LCA和T-UDCA)， 7-氧基DCA和7-氧基LCA]。数据矩阵表示为在线资源1。我们使用非标准化变量，因为它们都在相同的尺度上(µmol/g)，并且数据具有可比性。首先，我们通过树形图确定簇的数量，树形图是通过ward的方法[40]使用平方欧氏距离生成的。然后，使用基于平方欧氏距离的k均值聚类分析对参与者进行分类。K-means方法是应用最广泛的聚类方法之一，它需要预先设置聚类的数量[41]。随后，根据DCA和LCA的总浓度，将得到的一个簇进一步划分为几tile。

粪胆汁酸水平是按新鲜粪便量测量的，因此受到粪便含水量的影响。因此，我们对聚类分析生成的分类方案进行了分析，该方案还将分析中使用的粪便BSFS类型作为变量。两步聚类分析，也可以处理分类变量，被使用。包括BSFS类型在内的所有聚类分析获得的类别都是相同的，除了一个参与者的分类(见在线资源2)，后续分析的结果是相似的。所有聚类分析均使用Statistical Package for the Social Sciences Software Ver. 28.0 for Windows (IBM SPSS 28 Statistics base, Inc.， Chicago, IL, USA)进行。

统计分析

研究参与者的特征以均数±标准差(SD)或百分比表示。聚类间差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行评估。如果Levene检验显示方差齐性，我们使用Tukey检验进行事后两两多重比较;Games-Howell检验用于非均匀方差的样本。数据以mean±SD表示。为了更好地解释排便状态、肠道微生物群和习惯饮食与粪便BA组成的关系，我们对基于粪便BA组成的一些变量进行了主成分分析(PCA)，这些变量在聚类之间显示出显著差异。在线参考资料3中显示了PCA中使用的变量。所有统计分析均使用statistical Package for the Social Sciences Software Ver. 28.0 for Windows (IBM SPSS, Inc.， Chicago, IL, USA);P值< 0.05认为具有统计学意义。

目录

摘要 介绍 方法 结果 讨论 结论 数据可用性 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 #####

结果

参与者特征

与会者的特征请参见在线资源4。平均年龄为19.9岁，女性比例过高(92.5%)。平均BMI为21.2 kg/m2, 77.6%体重在正常范围内(18.5≤BMI < 25)。参与者排便情况如图1所示;80.6%的参与者在一周内BSFS平均评分为3 ~ 5分(正常粪便)(图1a)。正常排便次数的平均值±SD为6.7±3.9次/周(图1b);50.7%和73.1%的参与者在一周内分别没有硬便和水样便(图1c, d)。

研究居住在社区的年轻参与者一周的排便状况。参与者使用BSFS评估并记录了一周内排出的所有粪便。a每个参与者的BSFS周平均得分分布。b正常粪便排泄频率分布(BSFS型3-5)。c硬粪排泄频率分布(BSFS 1-2型)。d水样粪便排泄频率分布(BSFS型6-7)。BSFS布里斯托大便形态秤

总BA水平根据粪便形态的分布如图2所示。80.6% (n = 54)为正常粪便，16.4% (n = 11)为坚硬粪便，3.0% (n = 2)为水样粪便。粪总胆汁酸水平与BSFS型无显著差异(方差分析，p = 0.499，数据未显示)。

总胆汁酸水平根据所分析粪便形态的分布。在收集粪便时，参与者使用BSFS评估和记录用于分析的粪便的形式。BSFS类型1和2为硬便，3-5为正常便，6和7为水样便。BSFS布里斯托大便形态秤。测定每个新鲜粪便团块的胆汁酸水平

表1显示了参与者的粪便特征。在测定的17种BAs中，DCA和LCA占主导地位，平均值分别为1.57和0.89µmol/g;7-oxo-LCA、5种G-BAs和5种T-BAs分别仅在2名、4名和6名参与者的粪便中检测到。拟杆菌、Clostridium cluster XIVa和双歧杆菌占优势，平均相对丰度分别为29.9%、22.8%和19.4%。

参与者的分类

我们使用聚类分析，根据他们的粪便BAs组成对参与者进行分类。因此，生成了两个簇，一个是高水平的CA和CDCA(图3，簇4)，标记为高priba，另一个(图3，簇1-3)以DCA和LCA为主，并根据DCA和LCA的总浓度进一步划分为三层，分别标记为低secba、中secba和高secba。因此，参与者被分为四组(图3)。

生活在社区的参与者的粪便胆汁酸分析。DCA去氧胆酸、LCA石胆酸、CA胆酸、CDCA鹅去氧胆酸、UDCA熊去氧胆酸、G-BA甘氨酸共轭胆汁酸、T-BA牛磺酸共轭胆汁酸、priBA初级胆汁酸、secBA次级胆汁酸。G-BA和T-BA各含有5种胆汁酸(CA、CDCA、DCA、LCA和UDCA)。测定每个新鲜粪便团块的胆汁酸水平

不同BA群排便状态的差异

表2显示了BA群之间粪便BA水平和排便状态的差异，其中UDCA水平差异显著(方差分析，p = 0.034)。高priba集群的水平最高(Games-Howell测试;低secba vs.高priba, p = 0.029;中- secba vs.高- priba, p = 0.043;高secba vs高priba, p = 0.054)。另一方面，正常粪便的频率在BA集群之间存在显著差异(方差分析，p = 0.005)，其中低secba和高priba集群的正常粪便频率明显高于高secba (Tukey’s事后检验，p = 0.015;p = 0.011)。

BA群肠道菌群的差异

表3显示了BA群肠道菌群的不同。高priba集群中拟杆菌的相对丰度显著低于低、中、高secba集群(Tukey事后检验，p < 0.001;p < 0.001;p = 0.003)。在高priba组中，IV型梭状芽孢杆菌的数量明显少于高secba组(Tukey事后检验，p = 0.009)。此外，与低secba集群相比，高priba集群中梭状芽孢杆菌亚簇XIVa明显更多(Games-Howell检验，p = 0.029)。

BA群间习惯饮食的差异

表4显示了BA群中研究参与者的饮食特征。不同BA群动物蛋白和动物脂肪的摄取量差异显著(方差分析，p = 0.012和p = 0.002)，其中低secba群的摄取量最低。然而，不溶性纤维的摄入量显著高于高priba群(方差分析，p = 0.022)。

主要混合涂料整体分析

为了更好地解释排便状态、肠道微生物群和习惯饮食与粪便BA组成的关系，我们对6个显示BA群(梭菌群IV、拟杆菌群、梭菌亚群XIVa、正常排便频率、不溶性纤维和动物脂肪)显著差异的变量进行了主成分分析。动物蛋白被排除在外，因为它的摄入量被认为与动物脂肪的摄入量有关。主成分分析表明，第一主成分(PC1)解释了27.8%的方差，第二主成分(PC2)解释了22.8%的方差。PC1的主要变量为梭菌群IV、拟杆菌群和梭菌亚群XIVa;因此，PC1被认为是肠道微生物群的一个组成部分(图4a)。相反，PC2的主要变量是正常排便次数、动物脂肪和不溶性纤维;因此，PC2被认为是排便和饮食状况的一个组成部分。拟杆菌是PC1的主要组成部分，但也适度参与PC2(图4b)。

社区年轻参与者排便、饮食和肠道微生物群与粪便胆汁酸组成的关系根据粪胆汁酸组成对6个聚类间差异显著的变量进行主成分分析，得到两个主成分(PC1和PC2)。a PC1的因子加载。b PC2的因子加载。c根据胆汁酸聚类绘制参与者的PC1和PC2图。椭圆的中心为PC1和PC2的平均值，半径为标准差。采用Tukey事后检验的单向方差分析比较胆汁酸簇间PC1和PC2的差异。*Tukey事后检验，p < 0.001

参与者的PC1和PC2按BA聚类的分布如图4c所示。PC1中高priba集群显著低于其他三个集群(方差分析，p < 0.001, Tukey事后检验;高priba vs低secba, p < 0.001;高priba vs.中等secba, p < 0.001;高priba vs高secba, p < 0.001)。相反，PC2中低secba组显著高于高secba组，但不显著高于中secba组(方差分析，p = 0.002, Tukey事后检验，低priba vs高secba, p < 0.001;低secba vs.中secba, p = 0.055)。

讨论

为了探讨影响粪便BA组成的因素，本研究调查了一系列变量，包括排便状态、习惯饮食、肠道微生物群和粪便BA水平。该研究的参与者根据他们的粪便BA组成进行分类。在这项研究中，20.9%的参与者有高水平的粪便BA，主要是priba (CA和CDCA)(高priba簇)。该簇与梭状芽孢杆菌XIVa亚簇的相对丰度增加、正常粪便频率增加、拟杆菌和梭状芽孢杆菌IV簇的相对丰度降低有关。另外，高secba簇与高priba簇的总粪便BAs水平相同，但以secba为主，与动物脂肪摄入量增加、正常粪便频率和不溶性纤维摄入量减少有关。

与高粪便priBA水平相关的因素

梭状芽胞杆菌XIVa亚群的成员可能协助secba的产生。梭菌XIVa亚群中含有高BA 7α-去羟基活性的菌株[42]。Kakiyama等人研究了肝硬化患者和健康参与者的粪便BAs和肠道微生物群;他们得出结论，Ruminococcaceae和blautia (Clostridium xiva亚群的成员)的相对丰度与粪便secBAs水平呈正相关[43]。Murakami等研究了胃肠道疾病患者和健康参与者的粪便BAs和肠道微生物群，发现Clostridium subcluster XIVa的相对丰度与7α-去羟基化标记物DCA/(DCA + CA)比值呈正相关[20]。

我们发现Clostridium亚簇XIVa的相对丰度在不同secBA水平的分叶中呈近线性增加，尽管在高priba中最高。最近的一项研究估计，BA 7α-去羟基化仅占肠道微生物群总数的~ 0.0001%，并且大多数梭菌亚群XIVa成员缺乏7α-去羟基化的基因簇bai开子[44]。一项以大鼠为研究对象的研究表明，CA喂养增加了梭菌亚群XIVa成员的水平[45]。大肠中CA输入的增加可能进一步促进该簇成员的增殖[46]。另一方面，Clostridium亚群XIVa含有产丁酸菌[47]。在添加膳食纤维后，观察到仔猪和小鼠结肠中梭菌亚群XIVa的丰度增加[48,49]。

Zhao等研究了290例腹泻为主的IBS患者和89名健康参与者的ba相关代谢和宏基因组。他们的研究结果表明，UDCA和7-oxo-DCA可能通过抑制farnesoid X受体/成纤维细胞生长因子19信号传导来增强BAs的肝脏合成和粪便排泄[50]。一项针对病态肥胖患者的随机对照研究表明，UDCA通过降低循环成纤维细胞生长因子19和法脂类X受体激活来刺激BA合成[51]。有趣的是，高priba群的粪便UDCA和7-oxo-DCA水平显著高于其他群。虽然我们不知道是什么导致了高priBA群的高粪便priBA水平，但高纤维摄入和频繁排便可能促成了这一发现;需要进一步的研究来检验这个问题。另一方面，先前在功能性肠障碍和肝硬化患者中观察到粪便priBA水平升高[43,52]。

高粪secBA水平的相关因素

我们发现高的粪便secBA水平与较少的“正常”肠道运动和较高的动物脂肪摄入量有关。一项针对健康年轻人的随机对照喂养试验表明，食用高脂肪饮食6个月可增加粪便secBA水平[53]。一项短期饮食干预研究表明，动物性饮食显著提高了粪便DCA水平和微生物胆盐水解酶基因表达[24]。虽然有几项研究表明，大量摄入脂肪或动物性食物会增加基础分泌，并与粪便secBA水平升高有关[54]，但这些研究并未检查排便状况。相反，Thomas等人研究了肢端肥大症[55]和胆固醇型胆石症[56]患者的大肠运输时间与BA代谢酶的粪便活性之间的关系。他们发现结肠运输时间的延长与7α-去羟化酶活性的增加有关。因此，不频繁的排便和摄入高脂肪饮食可能会导致粪便secBA水平升高。在本研究中，高secba组的脂肪摄入量与中等secba组相当，尽管高secba组的参与者往往排便次数较少。

高secba集群成员可能产生更多secba，结肠癌[9]、胆石症[10]和肝癌[11]的风险更高。相反，高priba组的secba较低，但priba较高，排便更频繁，膳食纤维摄入量更高。不溶性纤维可以容纳大量的水;增加不溶性纤维的摄入可促进肠道蠕动并增加粪便量[57]。此外，纤维可以结合BAs [58];因此，增加饮食中不溶性纤维的摄入将促进粪便BA的排泄，从而有可能降低血清胆固醇[59]。然而，一些对IBS患者的研究表明，粪便中高水平的priBA可能与炎症和预后不良有关[1]。

我们的研究有一些局限性。首先，它的研究对象相对较少，而且主要由女性组成。粪便BA水平在男性和女性之间没有显著差异(数据未显示)，但据报道，结直肠运动和功能性便秘的患病率存在性别差异[60,61]。粪胆汁酸浓度是否因性别而异是一个有趣的问题。只有女性的数据集分析也产生了类似于包括男性和女性的分析结果(在线资源5)。其次，T-RFLP方法不能揭示细菌物种的作用，不如下一代测序。第三，BDHQ可以通过报告偏差来评估错误摄入。第四，因为BSFS分数是自我报告的，我们不能排除回忆或其他个人水平偏差的可能性。最后，这是一个横断面研究，没有对照组;因此，不能确定因果关系。

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